Dekalsifikasi – Histopatologi

Proses dekalsifikasi di makmal histopatologi

Takrifan

Dekalsifikasi tulang adalah penghilangan ion kalsium dari tulang melalui proses histologi sehingga membuat tulang menjadi fleksibel dan mudah untuk penyelidikan patologi iaitu melalui proses pembuangan garam kalsium dari dalam tisu yang telah dipotong tanpa merosakkan tisu tersebut.

 

PRINSIP

Proses pengeluaran deposit garam kalsium yang terkandung di dalam tisu adalah dengan menggunakan larutan dekalsifikasi yang sesuai tanpa merosakkan struktur tisu

 

SPESIMEN

Tulang atau tisu yang berkalsium

 

REAGEN RDO (rapid decalcifier) – hydrochloric acid

 

Tujuan

  • Membolehkan proses hirisan(sectioning) lebih sempurna
  • Elakkan kerosakan mata pisau mikrotom
  • Mengelakkan artefak

 

ciri-ciri agen dekalsifikasi yang baik

  • Boleh buang kalsium dalam masa yang singkat
  • Tidak merosakkan komponen tisu
  • Tidak mempengaruhi proses pencelupan

 

Contoh agen dekalsifikasi

  • Asid mineral – asid nitrit & asid hidroklorik(HCL)
  • Asid organic – asid formic
  • Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)
  • Elektrolit

‘DECAL-SOLUTION’

1.         Larutan ‘formaldehyde’ (40 %)                      100 ml

2.         Larutan ‘Formic Acid’                                    100 ml

3.         Air suling                                                        900 ml

 

PROSES KERJA DEKALSIFIKASI

 

1.         Prosedur yang digunapakai untuk memproses tulang, gigi, dan tisu ‘Calsified tisu’

2.         Proses dekalsifikasi ini bergantung kepada ketumpatan dan saiz spesimen.

3.         Larutan asid lemah digunakan dalam proses ini.

4.         Spesimen yang sudah siap di ’grossing’ dan diletakkan dalan kaset akan direndam dalam larutan dekalsifikasi (decal solution) sehingga tisu kelihatan lembut dan boleh dproses.

 

PROSEDUR

 

1.         kenalpasti jenis spesimen yang perlu dikalsifikasi

•           trephine biopsy

•           tulang

•           tisu yang berkalsium ( calcified)

 

2.         bagi specimen trephine biopsy

•           pastikan specimen telah di awet dalam 10% formalin

•           basuh spesimen dengan air

•           masukkan spesimen dalam bekas dan masukkan larutan RDO.

 

 

Biarkan selama 15-30 minit

 

•           periksa kelembutan spesimen

•           apabila spesimen lembut, basuhkan spesimen dengan air

•           proses spesimen menjadi blok tisu

 

3.         bagi spesimen tulang dan tisu berkalsium

•           potong tulang yang tebal dan keras ( compact bone )

•           bersesuaian dengan kaset tisu

•           awet spesimen dalam larutan 10% formalin

•           basuhkan spesimen dengan air

•           masukkan spesimen dalam bekas & masukkan larutan RDO

 

4.         periksa kelembutan ( endpoint) spesimen :

•           setiap 1-2 jam

•           setiap ½ – 1jam untuk tisu yang berkalsium

•           apabila spesimen lambut, basuh spesimen dengan air

•           proses spesimen menjadi blok paraffin. Rujuk pengendalian

spesimen tisu

 

5.         sekiranya paraffin blok spesimen di atas sukar untuk di potong kerana under decalcified

 

•           rendamkan permukaannya ke dalam larutan RDO selama lebih kurang 5-10minit

•           basuh permukaan dengan air

•           ulangi proses pemotongan blok paraffin tisu

•           rujuk pemprosesan , pembenaman, pemotongan, mount dan label

 

Teknik dan prosedur dekalsifikasi

  1. Tisu tulang atau tisu yang mengandungi kalsium dipotong kepada ketebalan 3 – 4mm,bagi sum-sum tulang,biopsi diletakkan antara span didalam kaset
  2. Fix dalam 10% formalin (sum -sum tulang dalam cecair Bouin)
  3. Selepas fiksasi,tisu dimsukkan dalam 5% asid nitrit atau 10%asid formik dengan HCL
  4. Selepas semalaman,periksa samaada proses dekalsifikasi telah lengkap atau pun tidak,sekiranya masih tidak lengkap,tukar agen dekalsifikasi tersebut dan biarkan semalaman lagi.(proses ini diulang sehingga ianya lengkap)
  5. Blok tisu seterusnya dibilas dengan 70% alcohol untuk menyingkirkan bahan asid

*Overdecalcification juga boleh merosakkan spesimen secara kekal

Perhatian

  • Pastikan spesimen telah diawet dengan sempurnasebelum proses ini dijalankan
  • Sekiranya proses pemeriksaan end point dekalsifikasi masih dapat mengesan kehadiran bahan kalsium,adalah dinasihatkan agar larutan ditukar baru dan masa eraman dipanjangkan
  • Larutan boleh ditukar dengan bahan uji lain

 

Kebaikan dan keburukan agen-agen dekalsifikasi

Asid nitrik

  1. biasa digunakan pada kepekatan 5% – 10%
  2. bertindak dengan cepat,tapi hasilkan kerosakan tisu jika kepekatanya 8% ke atas dan tisu telah berada dalam asid selama 2 hari
  3. sesuai untuk kes biopsi segera kerana masa dekalsifikasi antara 2 – 6 jam

kebaikan

  • bertindak dengan cepat

keburukan

  • kepekatan 8% dan keatas boleh merosakkan tisu
  • perubahan warna larutan dari daripada merah gelap ke kuning boleh menyebabkan pencelupan nukleus tidak memuaskan

Singkirkan asid yang berlebihan pada tisu selepas proses dekalsifikasi dengan menggunakan 5% sodium sulfat dan kemudian basuh dengan air mengalir selama beberapa minit.

 

Asid formik

  1. biasa digunakan dalam kepekatan 10%

kebaikan

  • memberi kesan pencelupan yang baik

keburukan

  • tindak balas lambat dan tidak sesuai untuk kes pendiagnosan segera
  • penyingkiran saki baki asid dengan 5% sodium sulfat memakan masa yang lama dan perlu dibiarkan semalaman pada air mengalir.

Dekalsifikasi asid seperti asid formik umumnya lebih cepat daripada EDTA chelation tetapi kajian menunjukkan bahawa kesannya mungkin mengakibatkan hidrolisis DNA. Namun, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa asid dekalsifikasi terhad (kurang dari 24 jam) di dalam 5% asid formik dapat mengekalkan DNA yang cukup untuk beberapa kaedah imunohistokimia.

 

TCA (Trichloracetic acid)

  • Sesuai untuk tisu yang diambil daripada pos mortem (bedah siasat)

Kebaikan

  • Nukleus tercelup dengan baik
  • Bertindak cepat dan mengekalkan morfologi tisu

Keburukan

  • Diperlukan dalam kuantiti yang banyak untuk menghasilkan kesan yang baik dalam proses dekalsifikasi
  • Memerlukan 3 kali ganda lebih larutan berbanding formik asid

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) – agen chelating

  • Biasa diguna dengan kepekatan 15% dengan ph neutral
  • Tindak balas lambat tetapi tidak merosakkan tisu walaupun berbulan-bulan
  • Dengan meningkatkan suhu ke 37°C,ia boleh membantu  cepatkan tindak balas
  • Ia jarang digunakan
  • Sesuai untuk penyelidikan kerana keupayaan penghasilan warna yang baik semasa pencelupan

EDTA merupakan agen chelating. Ini merupakan penyelesaian yang lebih baik untuk menghilangkan tulang pada tisu bagi ujian mikroskopi. Spesimen boleh didekalsifikasi dalam larutan ini selama beberapa hari sehingga ke beberapa minggu bergantung pada tahap dan saiz spesimen. Setelah dekalsifikasi, sampel boleh diproses secara rutin dan ditanam dalam parafin.

Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa bahan EDTA mempertahankan DNA yang lebih baik, dan lebih baik untuk analisis dan pewarnaan. Hal ini juga sesuai untuk sebahagian besar pendiagnosan imunohistokimia.

Elektrolit

  • Kaedah elektrolisis bagi memendekkan masa poses dekalsifikasi

Prinsip

  1. spesimen diikat dengan dawai platinum (anod) dalam bekas kaca berasid. Dekalsifikasi dicelup pada pemasangan elektrod dan spesimen bertulang. Garam kalsium ditukarkan kepada garam yang boleh diionkan kerana tindak balas asid dalam larutan.
  2. Kalsium berpindah dari anod ke katod (karbon elektrod)
  3. Suhu dikawal pada pada 30°C – 45°C,pembasuhan yang lama selepas elektroforesis tidak perlu kerana tisu telah dibilas dengan baik dalam air beralkali.

Kaedah menguji hasil proses dekalsifikasi( end point determination)

  1. ujian fizikal(kurang tepat dan berpotensi merosakkan spesimen)
    • menggunakan kaedah cucukan jarum dengan menusuk tisu yang telah menjalani proses dekalsifikasi
    • jika masih terdapatnya tulang dalam tisu tersebut,teruskan proses dekalsifikasi sehingga kesemua tulang tiada.

 

  1. Ujian biokimia

Gunakan 5% ammonium hidroksida dan 5%  amonium oksalat

Prosedur:
1. Masukkan pipet ke dalam larutan yang mengandungi spesimen.
2. Ambil sekitar 5 ml larutan dekalsifikasi (asid hidroklorik / asam formik) dari    bawah spesimen dan letakkan dalam tabung reaksi.
3. Tambah kira-kira 10 ml larutan ammonium hidroksida atau amonium oksalat,   sebatikan dan biarkan semalam.
4. Dekalsifikasi selesai bila tidak ada mendapan dilihat pada dua hari berturut-turut    ujian. Ulangi ujian ini setiap dua atau tiga hari.

  1. X-ray
  • Merupakan kaedah yang terbaik,tetapi jarang dilakukan kerana memerlukan kos yang tinggi.
Post ini telah dibaca sebanyak 3798

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*